赴美情况汇报（第7个月）——周玮

    到5月11日，从去年11月抵达美国整整6个月过去了，这也意味着在美国学习的时间已经过半，对家乡和亲人的思念也达到了顶峰。回顾这半年来的点点滴滴，喜忧参半，喜得是一人在外的日子过去了一半，可以倒计时开始了；忧得是这半年，感觉自己学的还远远不够，常常辗转反侧时自省吾身，总担心对不起卫计委、对不起医院、对不起支持我的领导、同事和家人。但与其夙夜忧叹，不如奋发图强，鞠躬尽瘁、死而后已。
    之前在四月底，考虑到可能是克隆相互污染或者是病毒载体转染时的多病毒序列插入，导致调控PR表达最强（达到40-110倍）的细胞克隆基因测序结果无法match到正确的结果，也就不能确定真正起作用的调控基因。因此挑选两个克隆再次进行流式细胞sorting筛选单细胞克隆培养。经过1个月的培养，有部分克隆已经生长出来，并进行了传代培养扩增，截止本周末，2018年6月1日，两个细胞已获得的克隆数分别为12个和14个，而从96孔板的单细胞克隆传代扩增细胞的确是一件很考耐性和细心的功夫活。出于成本考虑，还需要收集更多的克隆，首先提取RNA，重复RT—qPCR验证其PR mRNA的转录水平，如果各个克隆之间存在明显的不一致，则选择有显著差别的克隆分别行基因组DNA提取，sgRNA序列PCR和测序，通过这个方法来了解是否存在克隆互相污染的问题。对于第二种可能的干扰因素，即多基因片段同时传染导致测序异常，原先拟采取对测序结果进行排列组合法筛选，经再次论证并不可靠，如果排除了克隆污染问题，我们拟采取二代高通量测序的方法来明确究竟是有几个病毒序列插入，是哪些sgRNA靶向敲除起到了大幅上调PR转录的作用。
    当然，在单细胞克隆缓慢生长的过程中其他工作也不能停，毕竟在前期的克隆筛选和测序工作中我们已经发现了三十余种有潜在价值的基因，通过对相关研究相关文献的查阅，目前暂时确定了GLUD2，SGPP2，SOX9以及APH1A这四种作进一步的研究。具体的方案就是设计合成针对这四个基因的shRNA进行靶向干扰后，检测PR mRNA的表达水平；其次用相应的抗体和蛋白免疫印迹（western blots）检测PR蛋白水平变化。如果在这两个层面都能够证实PR的正向改变，那么无论从方法学还是结果都能形成很有意义的研究成果。
    此外，6月初导师的NIH R01项目标书要最后提交了，为了更充实研究基础的内容，在5月份，我们做了大量的western blots实验，检测各种药物和部分基因转染对PR表达的影响。从细胞培养、收集、裂解、蛋白质提取定量、western SDS胶块制作、蛋白电泳、转膜、封闭、一抗、二抗到显影，每一次实验的完整周期至少需要三天时间，这种实验最痛苦在于，不到最后一步，你永远不知道前面做的好不卵巢癌术后好，因为在整个过程看不见、摸不着，这是真正的“唯结果论英雄”了。一旦出现了失败，必须从头回想哪一步可能出哪样的错误。因此在整个实验过程中我也逐渐培养了仔细详实做好研究记录的习惯。
    5月份的临床科会里，我分别学习参加了“多囊卵巢与胚胎移植”，“肥胖人群的产程观察”，“妊娠期糖尿病患者的胎盘研究”等几项专题讲座。参加了科内“产后出血救治”、“子宫内膜癌患者术后肠瘘”的病例讨论。不得不叹服他们的严谨治学态度，非常值得我们学习。相信随着我们国家医疗改革不断深化，分级诊疗的落实，医患矛盾的缓解，我们也能不断前行，走出自己的路。